Во время «Зимней» советско-финской и Великой отечественной войны Никулин служил в Красной Армии. В 1950 окончил Студию разговорных жанров при Московском цирке. Работал в клоунской группе сначала под руководством Карандаша, а затем в дуэте с М.И.Шуйдиным. Никулин создал маску флегматичного, внешне несколько простоватого, но "себе на уме" человека, противостоящего своему энергичному и суетливому партнёру. Получил известность также как киноактёр, сыграв во многих любимых народом фильмах. Самыми известными являются кинокомедии с участием Никулина — «Бриллиантовая рука», «12 стульев», «Старики-разбойники».

Никулин создал незабываемый образ Балбеса из знаменитой тройки (Трус, Балбес, Бывалый) в кинокомедиях Леонида Иовича Гайдая «Самогонщики» (1961), «Пес Барбос и необыкновенный кросс» (1961), «Операция „Ы“ и другие приключения Шурика» (1965), «Кавказская пленница, или Новые приключения Шурика» (1967).

Юрий Владимирович играл не только комические роли — следует отметить его игру в фильмах о Великой отечественной войне («Они сражались за Родину»; режиссер — Сергей Федорович Бондарчук) и в фильме Андрея Тарковского «Андрей Рублев». Глубокий драматический дар артиста раскрылся в фильмах: «Когда деревья были большими» (1962), «Ко мне, Мухтар!» (1965), «Двадцать дней без войны» (1977), «Чучело» (1984) и др. Никулин - автор книги мемуаров «Почти серьезно...», выдержавшей несколько изданий. В 1990-е гг. был ведущим популярной телевизионной программы «Белый попугай», а также участником многих других передач. Подкупающая искренность, неподдельная человеческая теплота, умение расцвечивать жизнь снискали ему подлинно народную любовь.

С 1982 г. и до конца жизни был генеральным директором и художественным руководителем Московского цирка на Цветном бульваре. Никулину присуждены звания Народного артиста СССР (1973) и Героя Социалистического труда (1990). Скончался Юрий Владимирович 21 августа 1997 г. Возле цирка на Цветном бульваре, ныне носящем имя Никулина, установлен бронзовый монумент.